生物通報(bào)道 ：隨著測(cè)序成本的直線下降，解讀一個(gè)生物的基因組正在逐漸成為研究者們的日常工作。然而，并不是所有細(xì)胞都能夠達(dá)到測(cè)序要求，測(cè)序一般需要幾千到一百萬細(xì)胞。舉例來說，如果你研究的是早期胚胎發(fā)育，那么可用的細(xì)胞數(shù)量就很少，在這種情況下每一個(gè)細(xì)胞都很寶貴。

The Scientistzui近撰文詳細(xì)介紹了單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)研究中的一些關(guān)鍵技術(shù)。這些技術(shù)可以幫助我們?cè)趩蝹€(gè)細(xì)胞中檢測(cè)DNA、組蛋白和染色質(zhì)水平上的表觀遺傳學(xué)修飾。

染色質(zhì)水平的改變

高等生物的細(xì)胞核負(fù)責(zé)儲(chǔ)存基因組DNA，這些DNA環(huán)繞著由四種組蛋白組成的八聚體，形成碟狀的核小體結(jié)構(gòu)。基因組DNA以這樣的形式包裝成為染色質(zhì)，使DNA受到良好的保護(hù)。

所有控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控蛋白，都要結(jié)合在DNA上起作用。而染色質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)會(huì)隨著細(xì)胞生活周期而變化，調(diào)節(jié)調(diào)控因子所能接觸到的基因。

人們一般使用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)，在細(xì)胞群體中研究染色質(zhì)水平上的改變。但這種技術(shù)只能給出平均的3D結(jié)構(gòu)，“你無法了解單細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，”劍橋大學(xué)的Ernest Laue教授說。Laue教授之前參與的一項(xiàng)研究就解決了這個(gè)問題，找到了在單細(xì)胞中對(duì)染色質(zhì)彎曲和折疊進(jìn)行定量的方法。這個(gè)方法主要是Babraham 研究所的Takashi Nagano開發(fā)的，他成功將傳統(tǒng)Hi-C的基礎(chǔ)步驟應(yīng)用到了單細(xì)胞中。研究人員在單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核中交聯(lián)染色質(zhì)以保持環(huán)的形態(tài)，用酶消化掉非交聯(lián)的染色質(zhì)，然后連接自由末端并進(jìn)行測(cè)序，在。（延伸閱讀：Nature揭示染色體真實(shí)面貌）

進(jìn)行這樣的微量操作，需要我們?cè)诩?xì)節(jié)處理上一絲不茍。據(jù)Laue介紹，目前只有Nagano總能獲得一致性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，測(cè)序后的計(jì)算分析也是這個(gè)方法的關(guān)鍵所在，因?yàn)?/span>DNA擴(kuò)增會(huì)帶來許多噪音信號(hào)。

揭露組蛋白上的修飾

細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)改變也發(fā)生在組蛋白水平上，比如甲基化、乙酰化和磷酸化。現(xiàn)在人們已經(jīng)找到了在單細(xì)胞中成像組蛋白修飾的方法。美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)的Delphine Gomez和Gary Owens合作，通過熒光探針和原位雜交分析了平滑肌細(xì)胞里的組蛋白修飾。他們對(duì)鄰位連接檢測(cè)進(jìn)行了改良，利用二抗點(diǎn)亮存在表觀遺傳學(xué)修飾的組蛋白。雖然這一方法只能用于固定了的組織，但在不同發(fā)育階段對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，可以揭示隨著時(shí)間推移而發(fā)生的改變。（原文連接：Nat Methods, 10:171-77, 2013,）

如果你需要檢測(cè)活組織中的組蛋白表觀遺傳學(xué)修飾，你可以參考Kazuki Sasaki等人開發(fā)的檢測(cè)技術(shù)。這個(gè)RIKEN團(tuán)隊(duì)在熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新型感應(yīng)器，以監(jiān)控特定組蛋白殘基上的乙酰化。他們開發(fā)的探針稱為Histac，主要適用兩種熒光蛋白夾著一個(gè)組蛋白和一個(gè)能識(shí)別組蛋白乙酰化的溴區(qū)結(jié)構(gòu)域(Bromodomain)。當(dāng)乙酰化不存在時(shí)，Histac感應(yīng)器會(huì)生成很強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)組蛋白被乙酰化的時(shí)候，構(gòu)象改變會(huì)拉開兩個(gè)FRET元件的距離，生成較弱的熒光信號(hào)。研究人員用這個(gè)技術(shù)觀察了有絲分裂過程中的組蛋白乙酰化改變。不過Sasaki等人提醒道，目前這種探針需要向細(xì)胞中引入外源組蛋白，有改變細(xì)胞基因表達(dá)的可能。未來的新一代的Histac探針將會(huì)避免這一問題。

前景展望

對(duì)于前文提到的單細(xì)胞表觀遺學(xué)研究方法而言，污染問題都是重中之重，因?yàn)檫@類實(shí)驗(yàn)的樣本和試劑量都很小。如果你的DNA樣本很多，那么擴(kuò)增步驟通常能蓋過污染。但對(duì)于單細(xì)胞研究來說，“整個(gè)流程的每一步都有可能引入污染，破壞掉真實(shí)的信息，”Kelsey說。“我們可以參照二三十年前做PCR時(shí)的那些注意事項(xiàng)。”

研究者們普遍認(rèn)為，單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的下一步發(fā)展，是將多種研究方法的結(jié)合起來使用。在未來幾個(gè)月或者幾年里，我們將會(huì)看到能在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的技術(shù)。深入了解更多的單細(xì)胞信息，可以幫助人們理解不同細(xì)胞之間的差異，以及這些差異對(duì)發(fā)育或疾病狀態(tài)所產(chǎn)生的影響。

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